秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析

穆维娜，李玉成，武超，张学胜，王宁，高兆慧

（安徽大学资源与环境工程学院，安徽合肥230601）

　　摘要：采用实验室自制秸秆蓝藻混合厌氧反应装置进行沼气发酵实验，利用16S rＲNA基因克隆文库的方法，对不同产气阶段的细菌和古菌的优势菌群进行多样性研究。结果表明：①不同产气阶段细菌优势种类存在差异，供试秸秆沼气反应器阶段细菌种类较为丰富，分属于6个门：产气初始阶段优势菌群为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度为51.76%；产气高峰阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为47.13%；产气结束阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为28.89%；此外，还包括绿弯菌门、螺旋体门、绿菌门的细菌。②古菌种类明显少于细菌，均属于甲烷微菌纲（Methanomicrobia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和热原体纲（Thermoplasmata）。秸秆蓝藻沼气系统微生物群落结构的阐明具有一定的意义，可为秸秆沼气工程调控提供科学依据。

　　安徽省作为农业大省，每年都有大量的秸秆产生，主要农作物秸秆年理论资源量达4487.99万t，年可收集资源量达3878.84万t[1]。秸秆作为农业生产中的副产品是一种容易获取的生物能源，然而大量的秸秆被随意丢弃和焚烧，造成了极大的资源浪费和环境污染[2]。巢湖是中国第五大淡水湖，连通长江，巢湖的水质不仅会影响到其周边环境，还会影响到整个长江流域。巢湖水体近年来富营养化严重，蓝藻暴发成为环境问题。

　　蓝藻含丰富的有机质，是一种生物质资源[3]。厌氧发酵可以使秸秆和蓝藻转化为清洁能源，既保护了环境也使资源得到了利用[4]。秸秆是一种富含木质纤维素与其他多糖的有机质，而蓝藻中含丰富的蛋白质和藻多糖，利用含氮量比较丰富的蓝藻调节底物的碳氮比，可以提高发酵的效率[5-6]。彭书传等利用玉米秸秆和巢湖蓝藻进行混合厌氧发酵，与单一的玉米秸秆或蓝藻发酵过程相比，玉米秸秆和蓝藻混合发酵能够有效促进沼气的生成[7]。有机物厌氧降解过程主要分为水解发酵、产氢产乙酸及产甲烷3个阶段。其中水解发酵与产氢产乙酸阶段主要由细菌参与，涉及一系列复杂的化学代谢过程，生成乙酸等挥发性有机酸；而产甲烷阶段主要由甲烷古菌参与，将乙酸转化为甲烷[8]。沼气发酵过程需要不同阶段的微生物相互协作完成，因此沼气发酵过程中的微生物群落结构和功能的解析已经成为研究的热点[9]。目前国内外关于利用秸秆进行发酵的微生物群落研究主要集中在秸秆和禽畜粪便等常规原料的混合上[10]，而以秸秆和蓝藻混合发酵为对象的研究鲜有报道。分子生物学技术在微生物鉴定方面的应用，可以研究微生物在厌氧发酵过程中变化情况[11-13]。本文在秸秆蓝藻混合厌氧产气的基础上，通过构建16S rＲNA基因克隆文库，了解混合发酵不同阶段的细菌和古菌的优势菌群及其变化规律，为调控混合发酵过程提供微生物基本信息。结合不同产气阶段的产气率，解析沼气发酵各阶段优势微生物的功能，为优化秸秆沼气发酵工艺提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验材料 实验所用水稻秸秆采自安徽省周边某稻田，总固体（TS）含量为91.1%，挥发性固体（VS）含量为85.9%，晒干后剪至1cm左右待用；新鲜蓝藻采自巢湖塘西河口，总固体（TS）含量为1.96%，挥发性固体（VS）含量为91.58%，经滤网滤水后装入自封袋置于冰箱冷冻备用，实验时常温解冻待用；接种污泥采自实验室35℃中温厌氧发酵反应器剩余污泥，TS=3.9%，VS=72.51%，pH=7。

　　1.1.2实验装置 实验装置主要由发酵瓶、集气瓶、集水瓶组成（见图1）。

　　1.2方法

　　1.2.1发酵与取样 将处理后秸秆与解冻新鲜蓝藻按碳氮比为251混合成发酵原料。将原料分别置于4L厌氧发酵罐中，加入500mL厌氧污泥，配水至2.5L，调节反应总底物的pH至（7.0±0.05）。混匀后装入反应器内，用氮气对整个装置进行吹氮除氧0.5h以上。密封后进行厌氧发酵，发酵温度35℃，每天保证人为手动振荡摇晃发酵瓶2～3次，防止颗粒污泥沉淀或秸秆蓝藻浮于液面。共采样3次，分别在第1、7、29天取样，将样品依次命名为d1、d7、d29。样品采集前，先排空采样管道中残余的厌氧污泥，然后再将厌氧污泥向外流动几分钟后从反应器中取固液混合样30mL装入无菌聚丙烯离心管中，冻存于－80℃超低温冰箱。

　　1.2.2常规测试方法 TS：105℃烘至恒重；VS：于550℃马弗炉中烧至恒重；沼气产量：采用水压集气法，每日测量排出的饱和食盐水总量；甲烷含量：采用安捷伦7890A气相色谱测定。

　　1.2.3基因组DNA提取 基因组DNA的提取采用QIAamp DNA Stool mini kit基因组提取试剂盒。为了保证提取样品的基因组DNA的代表性，每个厌氧污泥样品平行提取3次，通过1%琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA的提取结果进行检测。

　　1.2.4克隆文库构建 用16S rＲNA基因通用引物分别对3个样品中的细菌和古菌的16S rＲNA基因片段进行PCＲ扩增。其中细菌引物序列为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492Ｒ（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）；古菌引物序列为AＲ109F（5'-ACKGCTCAGTAACACGT-3'），AＲ-912r（5'-CTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3'）。PCＲ反应体系与反应条件：预变性94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min（古菌16S rＲNA基因延伸时间1min），共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段并用胶回收试剂盒（TAKAＲA，大连）进行纯化。纯化的PCＲ扩增产物用pUC-mT载体（生工，上海）依操作说明进行连接，采用热激法将连接产物转化至Trans1大肠埃希菌感受态细胞（全式金，北京）中。通过蓝白斑筛选阳性克隆对于每个克隆文库，随机挑取96个白色克隆子进行PCＲ鉴定，引物采用M13F/M13Ｒ。

　　1.2.5酶切分型与测序 将鉴定为阳性PCＲ产物的片段用HhaI和HindIII限制性内切酶消化（37℃），酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，据酶切电泳图，将酶切图谱完全一致的克隆子划分为1个操作分类单元（operational taxo-nomic unit，OTU）[14]，统计各OTU所含阳性克隆的数量，每个酶切分型选取一个代表克隆送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。获得的16S rＲNA基因序列与测定序列在GenBank中进行BLAST同源性检索，使用MEGA6.06软件进行系统发育分析。

　　2结果与分析

　　2.1秸秆蓝藻混合发酵过程曲线

　　发酵期间日产气量及每日甲烷含量如图2所示。反应开始1d快速产气，7d达到产气高峰（397mL）。然后随着原料的减少而逐渐下降，在12d达到第2次产气高峰（300mL）。甲烷浓度在9d达到63%，随后小幅回落后上升，并保持50%以上；前12d为单日产气量较高，12d后进入缓慢增长期；推测在发酵12d后，系统中易产沼气的物质基本利用完毕，后期主要靠分解难降解物质来产沼气。29d产气基本停止。

　　2.2总DNA提取和PCＲ扩增

　　图3为蓝藻秸秆厌氧产气装置中样品总DNA提取电泳图，所用Marker为全式金的Trans15k，图中泳道1～3、4～6、7～9依次为样品d1、d7、d29平行样。由图3可知，提取的基因组较完整，大小在20kb左右，可进行下一步的16S rＲNA基因片段扩增。图4为样品d7总基因组细菌16S rＲNA基因PCＲ扩增电泳图，所用Marker为全式金的Trans2KPlus，图中泳道1、2为电泳试验平行样。电泳结果表明PCＲ扩增所产生的DNA片段大小约为1.6kb，说明得到的PCＲ扩增产物适合下一步的16S rＲNA基因克隆文库的构建。

　　2.3细菌种群群落分析

　　样品d1 96个克隆子阳性克隆85个，共有9个操作分类单元（OTU）；样品d7 96个克隆子阳性克隆87个，共有15个操作分类单元（OTU）；样品d29 96个克隆子阳性克隆90个，共有10个操作分类单元（OTU）。测得有效克隆子16S rＲNA基因序列在GenBank数据库中进行BLAST比对结果见表1。

　　由表1可知，随机挑选的克隆子与GenBank数据库中已知细菌的序列同源性最高为100%，最低为85%。由比对结果发现，厌氧颗粒污泥中微生物种群丰富，共分6个类群（见表2），分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacte-ria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chlo-roflexi）、螺旋体门（Spirochaetes）、绿菌门（Ignavi-bacteriae）。其中厚壁菌门、变形菌门与拟杆菌门为主要优势菌群，分别占3个样品细菌克隆子总数18.82%～47.13%、12.64%～51.76%、13.33%～35.63%。系统中微生物以变形菌和不可培养细菌为主。

　　通过分析不同发酵时间样品细菌群中丰度最大的OTU，可以了解不同发酵时间的重要细菌。3个不同发酵时间细菌群中丰度最大的OTU是不同的（见图5）。

　　d1细菌群中丰度最大的OTU为Pseudomonas sp.，属于变形菌门，占样品d1总克隆子数的30.6%。Pseudomonas sp.分离自土壤，为短杆状，革兰阴性，好氧菌，生长温度为4～65℃，可利用葡萄糖，不能水解淀粉[15]。d7细菌群中丰度最大的OTU为Bacteroides paurosaccharo-lyticus，属于拟杆菌门，占样品d7总克隆子数的27.6%。Bacteroides paurosaccharolyticus分离自稻草残渣，革兰阴性，严格厌氧菌，生长温度为10～40℃，最优35℃，可优先利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等，麦芽糖、糊精、糖原、淀粉和果胶也可利用，代谢产生乙酸、丙酸和琥珀酸[16]。d29细菌群中丰度最大的OTU为Dechloromonas sp.PC1和D.formicoaceticum，D.formicoaceticum属于厚壁菌门，占样品d29总克隆子数的23.3%，是一种严格厌氧的革兰阳性细菌，可利用甲酸、乙酸和少量的甲醇[17]；Dechloromonas sp.PC1属于变形菌门，占样品d29总克隆子数的24.4%，为革兰阴性短杆菌，微好氧，最适条件为25℃，pH7。

　　变形菌门是产气初始阶段的优势菌群。该门菌的纯培养主要分离自土壤、粪便、厌氧活性污泥等，可利用淀粉、长链脂肪酸及氨基酸等，具有水解作用，部分细菌有脱氮作用[18]。结合发酵装置中的物料及接种物，推测该菌很可能来自厌氧污泥或蓝藻；拟杆菌门是产气高峰阶段的优势菌群。该门菌主要分离自海底、肠道、厌氧反应器等厌氧环境，有降解大分子碳水化合物产酸的功能[19]；厚壁菌门是产气终止阶段的优势细菌种群，该门细菌已在厌氧消化污泥、废水处理反应器[20]、玉米秸秆厌氧反应器[21]等环境中被大量发现，主要进行纤维素降解、有机物水解、长链脂肪酸降解，生成小分子物质。

　　2.4古菌种群群落分析

　　样品d196个克隆子阳性克隆85个，共有8个操作分类单元（OTU）；样品d796个克隆子阳性克隆有84个，共有6个操作分类单元（OTU）；样品d2996个克隆子阳性克隆80个，共有4个操作分类单元（OTU）。测得有效克隆子16S rＲNA基因序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，其微生物所属古菌类别较为丰富（见表3）。在科和属分类水平上（见表4），11个古菌OTUs中可分为Methanoregula、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷微菌属（Metha-nosphaerula）、甲烷八叠球菌属（Methanosarci-na）、甲烷鬃菌属（Methanosaeta）、甲烷绳菌属（Methanolinea）、马氏甲烷球菌科（Methanomas-siliicoccus）与甲烷螺菌属（Methanospirillum）、甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae）。其中，Meth-anoregula和甲烷八叠球菌属为文库中的优势克隆，分别占克隆总数的15.1%和13.2%。

　　通过分析不同发酵时间样品古菌群中丰度最大的OTU，可以了解不同发酵时间的重要古菌。各样品在纲（Class）水平上的组成情况是不同的（见图6）。甲烷微菌在d1系统中占48.2%，到d7迅速升高至95.2%，d29后又有所下降，但仍占76.3%。甲烷微菌呈短、弯杆，不产芽胞，革兰阴性，极端严格厌氧。最适生长温度40℃，最适pH6.1～6.9。以H₂或甲酸盐为电子供体还原CO₂为CH₄，不利用乙酸、甲基胺和甲醇、H₂，可在瘤胃液中分离到。甲烷微菌纲含量变化规律与沼气中的甲烷含量变化规律相似，都是从d1后迅速上升并维持在高位，说明甲烷微菌纲古菌在该混合发酵系统中起主要作用。甲烷杆菌丰度则从d1的30.6%迅速下降到d7的0，随后d29也未检测出。甲烷杆菌极端严格厌氧，最适生长温度是37℃，可还原CO₂为CH₄，不能代谢甲基胺和乙酸，不能固氮，可在水田、沉积物或其他缺氧的环境分离到，推测装置中甲烷杆菌来自厌氧污泥。热原体纲在d1和d7未检测出，而在d29丰度较高，占23.8%。

　　在属（Genus）分类水平上，d1古菌群中丰度最大的2个OTU依次属于甲烷微菌属（22.3%）、甲烷杆菌（18.8%）；d7古菌群中丰度最大的2个OTU为Methanoregula（42.9%）、甲烷八叠球菌属（27.4%）；d29古菌群中丰度最大的2个OTU为甲烷粒菌属（37.5%）、马氏甲烷球菌科（23.8%）。

　　3讨论

　　本研究首先采用实验室自制秸秆蓝藻混合厌氧反应装置进行沼气发酵实验，再分别采集产气初始期（d1）、产气高峰期（d7）和产气终止期（d29）的厌氧发酵液，利用16S rＲNA基因克隆文库的方法，对不同产气阶段的细菌和古菌进行多样性研究。尽管利用该技术不能反映样品中所有的微生物类群，但可以反映样品中主要的优势细菌、古菌类群。

　　系统发育分析表明，整个发酵过程中共检测到6个门类的细菌，即厚壁菌门（31.7%）、拟杆菌门（27.5%）、变形菌门（29.4%）、绿弯菌门（1.5%）、螺旋体门（4.2%）、绿菌门（5.7%）。这与其他秸秆产气装置典型类群一致。例如，张蕾等[19]应用16S rＲNA基因克隆文库技术对四种规模化秸秆产气装置中微生物的群落分析中发现，厚壁菌门、变形菌门与拟杆菌门为优势种群。

　　Yan等[22]发现稻草沼气系统细菌主要归属于拟杆菌门、变形菌门、脱铁杆菌门（8.9%）和厚壁菌门。Klocke等[23]发现青贮甜菜沼气系统中优势细菌主要归属于厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。乔江涛等[9]对玉米秸秆厌氧发酵过程的细菌群落结构进行研究，结果发现厚壁菌门、拟杆菌门、互养菌门及热袍菌门为优势菌群。d1细菌群中丰度最大的OTU属于变形菌门（30.6%），d7细菌群中丰度最大的OTU属于拟杆菌门（27.6%），d29细菌群中丰度最大的OTU属于变形菌门（24.4%），这与袁月祥等[21]对玉米秸秆产生物燃气及其微生物群落解析结果相比发现，产气初始和高峰优势菌群一致，而产气终止的优势菌群不同，推测是由于物料中添加蓝藻，发酵装置含氮量升高导致变形菌门丰度随之升高。这些沼气系统中丰度最大的几个门基本上都是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，但含量有些变化，且不同细菌在发酵过程中的丰度变化趋势不同。以上结果表明，拟杆菌门和厚壁菌门在富含纤维素的有机废弃物厌氧发酵过程中发挥着重要作用，需要结合反应器的运行参数与运行状况，进一步研究这些优势微生物在沼气发酵过程中群落演替与代谢功能。

　　通过构建古菌克隆文库，得知各样品所测得的OTU都归为广古菌门。分别属于甲烷微菌纲、甲烷杆菌纲和热原体纲。其丰度变化与袁月祥等[21]对玉米秸秆产生物燃气及其微生物群落解析中的古菌含量随发酵时间变化情况基本吻合。张蕾等[19]在规模化秸秆沼气发酵反应器中微生物群落特征时，古菌序列均属于甲烷杆菌纲和甲烷微菌纲。杨承剑等[24]应用16S rＲNA基因克隆文库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性中发现，所有古菌群落均属于甲烷杆菌目、热原体目、除硫球菌目。以上实验均是只研究了一个时间点，本实验研究了混合发酵系统中古菌的变化情况。通过比较推测，蓝藻的添加对厌氧发酵产沼气装置中古菌群落影响不大，不同发酵时间古菌变化趋势与以秸秆为单一物料产沼气的趋势基本相同。不同发酵原料对沼气系统古菌的多样性的影响有待进一步研究。